STM|以毒攻毒_哈佛医学院董民团队攻克肉毒杆菌中毒难题

肉毒素是一类由革兰氏阳性菌肉毒杆菌(Clostridium Botulinum)及同属相近菌所产生的蛋白质毒素。该毒素家族目前已知有七种亚型(BoNT/A到BoNT/G)【1】。该类毒素是目前自然界……

肉毒素是一类由革兰氏阳性菌肉毒杆菌(Clostridium Botulinum)及同属相近菌所产生的蛋白质毒素。该毒素家族目前已知有七种亚型(BoNT/A到BoNT/G)【1】。该类毒素是目前自然界中已知的毒性最高的毒素之一。在美国,肉毒素被列为六类最危险的管制药物之一,是潜在的生物恐怖袭击制剂 (Arnon et al., 2001)。这类神经毒素特异性的靶向宿主运动神经,阻断神经递质的传递,造成肌肉麻痹和松弛性瘫痪,导致病人行动无力和无法呼吸。七种亚型中,BoNT/A和BoNT/B所导致的肉毒杆菌中毒居多。得益于肉毒素对运动神经元的特异性,A和B亚型也被越来越多的用于治疗由神经过度兴奋引发的肌肉障碍相关的各种疾病。肉毒素为大众所熟知的应用是在美容上用于消除皱纹。

肉毒素家族蛋白是由单一基因编码的双链蛋白,该蛋白在合成后需由蛋白酶激活从而切割成两条链,包括轻链和重链。轻链由蛋白酶结构域组成,其本身是一种蛋白酶,可以特异性的切割神经元内负责囊泡与细胞膜融合的相关蛋白,包括VAMP1,2和3,SNAP-25以及Syntaxin 1。正是由于轻链的这一特性,它是肉毒素能够阻断神经信号传递的最终执行者。重链包含两个结构域,位于N端的跨膜区及C端的受体结合区。在蛋白质结构层面上,三个结构域相对独立,分工明确。受体结合结构域负责识别在神经元上的特异受体;跨膜结构域协助轻链转移到细胞内部;轻链在胞质内切割底物从而阻断神经递质的释放。

对于治疗由BoNT/A与BoNT/B所导致的肉毒杆菌中毒,其主要的难点在于毒素进入神经元后其轻链在细胞质中的半衰期极长,从而导致持续性的神经阻断及肌肉瘫痪。这些症状可以持续数月,临床上还没有药物能够抑制已经进入神经元内的毒素。一旦中毒,病人需要得到深度护理及辅助性的呼吸装备得以维持生命,这一过程长达数周至数月不等。由于周期长,肉毒杆菌中毒的治疗会导致高昂的医疗费用。而且一旦遇到大规模爆发,极易导致医疗设施的短缺。

开发治疗肉毒杆菌中毒的药物的研究由来已久,但迄今为止,还没有小分子药物能在神经元内有效的抑制肉毒素的酶活性。抗体药物也仅能中和循环系统中存留的毒素。2020年1月7日,哈佛医学院和波士顿儿童医院的董民博士的实验室在Science Translational Medicine在线发表了题为“Delivery of single-domain antibodies into neurons using a chimeric toxin–based platform is therapeutic in mouse models of botulism”的文章,该研究用蛋白工程的方法开发了以融合毒素为平台将纳米抗体递送至神经元细胞内来治疗肉毒杆菌中毒,为快速有效的治愈肉毒杆菌中毒迎来了新的曙光。

在此项研究中,作者充分利用了肉毒素极高的神经特异性,用基因工程突变的方法开发了失去毒性的肉毒素,并用其为载体将纳米抗体递送至神经元细胞内去中和A亚型和B亚型毒素。在此之前,已有其他实验室尝试过利用失活的BoNT/A 和BoNT/C等传统肉毒素亚型作为药物递送工具。尽管这些载体在经过突变后在体外并不具有酶活性,但被注射到小鼠体内后,小鼠仍然表现出肉毒杆菌中毒的症状及死亡,其背后机制尚不明朗。为解决这一安全性上的问题,董民博士的实验室另辟蹊径,尝试改造了一种新发现的肉毒素亚型BoNT/X。这种毒素是董民博士的实验室于2017年发现的一种新型类肉毒素,具有很多特别的生化特性,包括更广谱的底物切割及更高效的转膜结构域 (Zhang et al., 2017)。因为BoNT/X本身不靶向运动神经元,作者只利用了X型毒素的蛋白酶结构域和跨膜结构域作为药物跨膜转运工具,同时用A, C, D肉毒素亚型的受体结构域来靶向运动神经元, 从而产生了人造的嵌合型肉毒素(称作BoNT/XA,BoNT/XC和BoNT/XD), 并通过突变关键的X型毒素酶活性位点的方法去除毒性用以作为递送载体。

在将针对A亚型的纳米抗体(A8)与去除毒性的BoNT/XA,BoNT/XC和BoNT/XD融合后(下文称作A8-ciBoNT/XA,A8-ciBoNT/XC和A8-ciBoNT/XD,见图一),作者首先在体外培养的神经元上对其进行了测试,发现这些融合蛋白均能有效的抑制已进入神经元内的A亚型毒素的活性, 其中以A8-ciBoNT/XA的抑制效果最佳。接下来作者对这些融合蛋白在小鼠内的毒性进行了评估。当给小鼠注射100 mg/kg的A8-ciBoNT/XA,A8-ciBoNT/XC和A8-ciBoNT/XD时,小鼠仍然无任何中毒症状, 从而解决了一直以来困扰的残余毒性问题。

STM|以毒攻毒_哈佛医学院董民团队攻克肉毒杆菌中毒难题 生活头条 第1张

图一:嵌合蛋白的构建和作用机理

作者然后以小鼠为模型及利用不同的给药方式对A8-ciBoNT/XA的药效进行了进一步的评估。在对小鼠的后肢进行局部注射BoNT/A后,该后肢会呈现出松弛性瘫痪症状,在没有药物干预的情况下,该症状会持续长达约40天至消失。在先注射BoNT/A后18小时,在相同的部位再次注射0.6微克的A8-ciBoNT/XA后,肉毒素造成的局部肌肉麻痹在几小时内开始缓解, 小鼠在2天内即可完全恢复正常。作者然后通过给小鼠腹部注射致死剂量的BoNT/A以诱发全身性的中毒症状,约9小时后小鼠即呈现出行动困难。在无药物干预的情况下,数小时后小鼠即表现出无法行动和呼吸困难。在注射BoNT/A后9小时,再通过腹部注射30微克A8-ciBoNT/XA,小鼠的中毒症状在6小时内消失并恢复正常的行动能力(见图二)。

STM|以毒攻毒_哈佛医学院董民团队攻克肉毒杆菌中毒难题 生活头条 第2张

图二:A8-ciBoNT/XA能有效的治愈BoNT/A引发的全身性肉毒杆菌中毒

最后作者采用一石二鸟的策略,将两个能分别中和BoNT/A与BoNT/B的纳米抗体(A8和J10)同时融合到消除毒性的BoNT/XA(蛋白称作A8-J0-ciBoNT/XA)。在小鼠模型中, A8-J0-ciBoNT/XA可以同时治愈由BoNT/A和BoNT/B引发的肉毒杆菌中毒。

该研究第一次建立了可以在肉毒素中毒症状出现以后的治疗方法。同时在临床上也可以用来快速消除由于不当使用肉毒素造成的肌肉麻痹,从而为肉毒素的安全使用提供了新的保障。这项研究也建立了一套有效的蛋白药物递送工具,可以把蛋白药物特异性的靶向神经元,并且高效的跨膜进入细胞内部。这一技术有潜力广泛的应用于递送蛋白药物到靶向细胞内部,从而可以突破目前的蛋白药物只能针对细胞表面靶点的局限性,让开发针对细胞内的药物靶点的蛋白药物成为可能。

董民博士的实验室在肉毒素领域深耕多年,在多个方面均有重要的发现,如肉毒素受体的鉴定及其识别机制和开发医用上更高效肉毒素。同时实验室还先后发现两个新的类肉毒素,本研究中所采用的BoNT/X就是其中之一,均具有较高药用价值。

https:https://stm.sciencemag.org/lookup/doi/10.1126/scitranslmed.aaz4197

参考文献

1. Dong, M., Masuyer, G., & Stenmark, P.(2019). Botulinum and tetanus neurotoxins. InAnnualReview of Biochemistry.https:https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-013118-111654

2. Arnon, S. S., Schechter, R., Inglesby, T. V.,Henderson, D. A., Bartlett, J. G., Ascher, M. S., Eitzen, E., Fine, A. D.,Hauer, J., Layton, M., Lillibridge, S., Osterholm, M. T., O’Toole, T., Parker,G., Perl, T. M., Russell, P. K., Swerdlow, D. L., & Tonat, K. (2001).Botulinum toxin as a biological weapon: Medical and public health management.Journalof the American Medical Association.https:https://doi.org/10.1001/jama.285.8.1059

3. Zhang, S., Masuyer, G., Zhang, J., Shen, Y.,Henriksson, L., Miyashita, S. I., Martínez-Carranza, M., Dong, M., &Stenmark, P. (2017). Identification and characterization of a novel botulinumneurotoxin.Nature Communications,8.https:https://doi.org/10.1038/ncomms14130

声明:CNohd.com 本媒体部分图片、文章来源于网络,如有侵权,请与我联系删除。
新媒网 » STM|以毒攻毒_哈佛医学院董民团队攻克肉毒杆菌中毒难题